<td id="yu3zz"><strike id="yu3zz"></strike></td><track id="yu3zz"><ruby id="yu3zz"></ruby></track>
  • <output id="yu3zz"></output>

  • <acronym id="yu3zz"><label id="yu3zz"></label></acronym>

  • 科普知識

    首頁>科普知識>狂犬知識

    第七節 存在的問題和疫苗研究現狀及展望物學

    時間:2018-01-24

    一、存在的問題

    (一) 不同地區的病毒變異問題

    近年來,我國狂犬病發病率有所回升,而且通過研究表明,不同地區的狂犬病病毒株其核酸序列存在著一定的差異,差異最大者,其G蛋白同源性僅為84%?,F在,有必要了解這種核酸序列的差異是否會影響到疫苗的保護效果。

    (二)早期診斷

    現有的診斷試劑均是測定抗體的,然而,在癥狀出現前若能確診為已被感染,對指導使用疫苗、抗血清等才有實際意義。PCR技術和核酸雜交技術檢測體內的微量 抗原是可行的,可作為早期診斷技術與試劑。乳膠凝集試驗檢測狗唾液病毒的結果與熒光抗體試驗法相當。

    (三)工藝技術與檢定方法的改善

    目前,我國Vero細胞培養狂犬病疫苗的生產工藝均以轉瓶細胞培養法,此工藝無法實現疫苗的大規模生產,因此,大規模細胞培養技術已成為大批量生產狂犬病 疫苗的制約因素。利用生物反應器大規模培養細胞技術可解決此問題;同時也是疫苗制造工藝的發展方向。

    NIH效力測定法存在一些問題,例如:同一批次疫苗在不同的時間和操作者的不同,其檢定結果可偏差3倍,而且,攻擊毒的毒力、參考對照疫苗效力單位的高低 等均可影響結果。國外許多廠家為了減少這種誤差,均做雙份檢定,取平均值作為疫苗的效力單位。在尚無更好的測定方法的情況下,這不失為一種補救的辦法。

    近年來,已有許多學者在探索以測定疫苗抗原含量的標準來確定疫苗的效力單位。

    二、發展中的疫苗

    (一)基因工程重組疫苗

    利用基因工程技術開發新型疫苗,其中核酸疫苗和亞單位疫苗可用于人類。重組體疫苗和基因工程活疫苗主要用于野生動物和家養動物。

    1.重組體疫苗 某種載體病毒經基因工程改造后,在其包膜上表達自身蛋白的同時又表達另一異源蛋白抗原。將G蛋白基因逆轉錄成cDNA片段,插入痘病毒基因組內,再將這種 帶有外源基因的痘病毒感染BHK-21細胞,收取病毒懸液,經蔗糖梯度離心部分純化制得“痘病毒-狂犬病病毒糖蛋白重組體病毒” (V-RG) 疫苗,使用對象是野生動物,狐、浣熊經口服免疫后,中和抗體水平為0.6~54IU,抗體維持時間較長。

    VRG疫苗的安全性受到質疑,2001年美國學者曾報道,一婦女被她所養的狗咬傷后,出現痘病毒感染,經實驗證明此痘病毒與該狗曾接種的疫苗是同一病毒(17)。

    2. 基因重組亞單位疫苗 在國外,用痘苗病毒作為表達載體,分別表達G蛋白、N蛋白、NS蛋白與M蛋白,但是G蛋白與N蛋白的免疫保護效果明顯高于NS蛋白與M蛋白亞單位抗原。在 我國有報道,將G蛋白與N蛋白的基因引入載體病毒基因中,可同時表達這兩種蛋白;也可構建成融合蛋白形式。表達載體有昆蟲細胞、酵母菌等。以此表達物免疫 動物較單一G蛋白免疫效果好,T細胞的應答作用明顯,協同免疫效應增強、有較好的抗街毒攻擊保護效果。疫苗的使用對象,既可是動物又可是人?,F尚在實驗室 階段。國外有報道,以酵母菌表達G蛋白的同源類似體,分別為68KD和65KD分子量。

    3. 核酸疫苗 國內外進行的核酸疫苗研究,主要集中在G蛋白與N蛋白基因的選取上,表達載體多選取帶有病毒啟動子的質粒等,其抗體陽轉率在30~50%之間或者略再高 些,抗體滴度亦不甚理想。有報道,用含抗原結構基因的質粒作為裸露DNA疫苗,以基因槍肌肉接種8個猴,然后以致死量病毒攻擊,8個猴均存活??傮w說來, DNA疫苗的弱點是,在接種后30天內,難以測到抗體,故不適合作為接觸后的預防免疫,而且其免疫效果等也尚未達到人用常規疫苗的水平,仍需進一步的改 進。目前也僅在實驗室階段。對核酸疫苗的原則性要求:有足夠量的基因進入機體;在體內能表達足夠量的抗原;并能較快地有效激活免疫系統;而且遠期安全性好 (指整合、誘變等)。

    但是,也有些學者據小鼠試驗結果提出相反的觀點,認為僅單一劑量的DNA疫苗用作接觸后的預防免疫其保護率為53%、第7天出現抗體陽轉,5針次CCV的保護率為40%(18)。

    4.基因工程活疫苗 野生動物常規使用的改性活疫苗(modified-live)是口服的SAD B19、SAG-2以及VRG疫苗,對狐是非常有效的,但對臭鼬的效果不顯著或無效。因此,美國的研究人員用基因反轉法和基因工程點突變法,將G蛋白的 Arg333替換成Gln333、以及改變胞漿區及胞漿外區的氨基酸序列,這種改構的病毒體對外周神經無神經侵染特性(19)。此活疫苗的使用對象是野生 動物。

    口服活疫苗必須滿足的關鍵點:①疫苗病毒應能在受者體內復制,以至有足夠量的抗原被提呈給免疫系統;②疫苗病毒株的抗原組成與攻擊毒株應緊密關聯;③疫苗 必須能引出或提供足夠的保護性免疫。④活疫苗毒株應該降低入侵神經的能力。在構建新型活疫苗時,也可考慮利用G蛋白胞漿功能區與RNP-M復合物之間的錯 配足于使病毒減毒這一原理。

    在過去的研究中,疫苗抗原的重點均放在G蛋白,但近年來有些報道,以純化的RNP或重組的N蛋白作為疫苗抗原進行動物試驗,結果顯示均有較好的保護效果。 如果先以N蛋白刺激宿主,再用CCV接種,可加快機體出現高滴度的抗體。

    (二)探索性研究的疫苗

    1.口服疫苗 將分離純化的ERA株RNP作為疫苗抗原,免疫小鼠能激惹特異性T細胞以及引出抗N蛋白特異性抗體。RNP經口服與肌肉注射途徑均可引出血清IgA和 IgG抗體應答;如果再給予滅活疫苗加強免疫,能刺激產生較高的中和抗體量。

    2.轉基因植物表達抗原(植物病毒表達抗原) 利用植物病毒——煙草花葉病毒的重組嵌合體在菠菜葉中表達狂犬病病毒G蛋白的兩種抗原決定基,將這種菠菜葉以胃插管法或喂食法口 服免疫小鼠,確實能引發局部和全身免疫應答,產生血清IgA和IgG中和抗體;經肌肉注射作為第三次免疫刺激后,約有40%的小鼠能夠對抗致死量狂犬病病 毒的攻擊。

    3.其它亞單位疫苗

    (1)免疫小體與病毒小體 去除滅活病毒的核心,將糖蛋白與脂質體交聯形成免疫小體。注入機體可引出高水平的中和抗體,并能耐受街毒的攻擊;推測其保護效果比純化的G蛋白或病毒小體 要高20倍;而且穩定性好。(2)抗獨特型McAb作為疫苗抗原,1983年以前曾有報道,用Ab2-β型抗獨特型抗體,免疫動物可引出低滴度 的中和抗體。

    4.混合多價疫苗

    用液體吸附型破傷風類毒素來溶解凍干型狂犬病疫苗,立即給被瘋動物咬傷者使用,有明顯的協同促進作用,為試制破傷風類毒素與狂犬病疫苗二價疫苗奠定基礎。

    (三)佐劑的研究

    目前疫苗的佐劑是氫氧化鋁、皂角苷類的QS21,但是,氫氧化鋁的有效性是受到質疑的。免疫刺激復合物(ISCOM)主要用于獸用口服疫苗,抗原與皂角苷 膽固醇等物形成乳化小顆粒;實驗證明ISCOM的免疫原性比原制苗要高幾倍。

    近年來,有許多佐劑的研究,其中有細胞因子和CpG。CpG是一種未甲基化的二核苷酸基序(motif),含6個核苷酸;CpG-ODN則是含CpG基序 的寡核苷酸,又稱特異性免疫刺激序列(ISS),來自細菌的質粒核酸。業已證明它具有強烈的佐劑性,能引出Th1型免疫應答,參與IgG2a定向應答;它 還提高抗體應答的血清陽轉率并能擴大抗體的產生量。它提高細胞表面共刺激分子的表達,它刺激NK細胞產生IFN-γ;以及提高NK的溶細胞活 性。目前在哺乳類動物中的研究不多,僅見于HBsAg、BCG、HIV-DNA疫苗、流感病毒亞單位疫苗等研究。有望為狂犬病疫苗探索出一種新的佐劑。它 可用于多種疫苗制劑包括DNA疫苗。

    1979年WHO公報中曾提出,在疫苗中加入干擾素及其誘生劑,比單一使用疫苗更有效。有研究表明,來源于沙門氏菌脂多糖的單磷酸脂A(MPL)亦可作為DNA疫苗的佐劑。

    三、接種途徑和免疫接種計劃

    WHO于2002年提出,由于經濟和疫苗供應的問題,可考慮將多位點的皮內免疫接種途徑推廣應用為接觸后的疫苗接種方法,從而降低疫苗需要量的60%;但 應慎重評價其免疫效果;而且必須使用組織培養疫苗;WHO提出這種建議的原因是出于,多位點的皮內免疫接種途徑從1982年起經多次現場考察,證明也是一 種有效的免疫途徑,同時又可以節省疫苗使用量。另一方面,對于那些狂犬病猖獗的社區,WHO也鼓勵經仔細地設計,將現代狂犬病疫苗接種列入嬰幼兒和兒童的 早期免疫計劃中。

    四、治療用特異性抗體

    從發展趨勢看來,單克隆抗體(McAb)作為治療制品是有利的,無論是鼠源性的還是人源性或人源化的,只要McAb的特異性與針對性是抗病毒致病原性的, 例如抗G蛋白致病決定基的McAb,均可抑制細胞之間的病毒傳播,為機體提供早期的被動免疫保護。此外,因McAb可被狂犬病病毒感染的細胞所內化從而進 入細胞,它在胞內可抑制病毒脫殼。

    從另一方面看來,McAb制備技術不但可保證大量生產以滿足臨床使用的需求量,而且也可提高產品質量及藥效,這因為其特異性高針對性強、而且因其比活性高 于HRIG,故所使用的蛋白量低,這是它的優勢所在。因此,WHO也希望McAb是一種值得發展的新技術方向,而且提出McAb作為抗狂犬病治療制劑應是 2~3種McAb混合的雞尾酒型制劑。

    最近有報道,利用人源性抗狂犬病病毒的中和性McAb進行敘利亞地鼠接觸后的預防治療性試驗(20),7株McAb和對照的RIG在體外基本不中和第2至 第7血清型的RRV。對狂犬病病毒攻擊后的保護作用與RIG相同,同時也僅對個別RRV產生保護;有1株McAb對地鼠所提供的保護與RIG相當, McAb有希望成為RIG的代用品。研究者還認為,IgM類的McAb中和效應無法與IgG類McAb相比,而且,盡管使用高劑量,但仍不能提供保護效 果,這因為是IgM空間效應所致而不易接近狂犬病病毒,并且IgM只能留在循環系統內,反之IgG則容易穿過各種組織。

    亚洲无码在线