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    第五節 現行疫苗的制造與檢定

    時間:2018-01-24

    據2002年WHO的報告,目前,在世界上使用的狂犬病疫苗既有腦組織疫苗,如主要在第三世界使用的山氏疫苗 和弗氏疫苗,又有細胞培養疫苗及其精制純化疫苗。這是病毒性疫苗中的奇觀,其它疫苗都是發展新一代后,就淘汰前一代,只有狂犬病疫苗是一直在發展,而老疫 苗又未完全被淘汰。這可能由于制造技術發展、科學知識水平以及受經濟能力限制的制約結果。腦組織疫苗除可誘發變態反應性腦脊髓炎之外,現在科學試驗還證 明,人的新變異型克雅?。∟vCJD)與接種羊腦組織疫苗有關,完全淘汰腦組織疫苗為期不遠了。我國現在使用精制細胞培養疫苗,與發達國家同步。

    主要介紹WHO向全世界推薦或國際上公認的四種疫苗,下面按病毒培養的細胞基質分類敘述之。

    一、原代地鼠腎細胞疫苗(PHKCV)及其精制疫苗

    目前,我國、加拿大、俄羅斯等國家都采用此細胞培養疫苗。原制疫苗的制造原理及工藝大同小異,以我國現行生產工藝流程為例。我國的原代地鼠腎細胞疫苗經歷 過原制(佐劑)疫苗、其后是濃縮疫苗、最終發展成為精制疫苗,前兩種疫苗劑型已被淘汰。為了便以理解,故將三種疫苗劑型分開敘述。

    1,原制疫苗及其佐劑疫苗:

    用aGT株的豚鼠腦病毒培養物(選自有典型狂犬病表現的豚鼠)作為生產用毒種,以1:1500左右的病毒量感染已長成單層的原代地鼠腎細胞,溫度37℃吸 附3天,傾倒去除病毒毒種與細胞生長液,用 Hanks液洗滌細胞,再用 SMl或199培養液為維持液培養,33~37℃培養4天,收取病毒培養液,加福爾馬林使最終濃度為 l/5000,37℃滅活24~48小時,然后過濾去除細胞碎片,合并,加 l/萬的硫柳汞防腐,即為疫苗原液。培養溫度的不同,病毒產毒高峰時間亦不同,例如,33~35℃培養,病毒產毒高峰期在5~6天,37℃培養則在第4 天。疫苗原液加氫氧化鋁使最終濃度為0.5mg/ml,制成佐劑疫苗。經無菌試驗、安全試驗、效力試驗合格后,即行分裝、包裝制得疫苗成品。此疫苗經十多 年的應用,對控制狂犬病的發病率和降低疫苗接種后的副反應起到較大的作用,但是,由于較難保證疫苗的效力恒定在每劑2.5IU以上,而且穩定性亦不佳,故 增加濃縮工藝流程以確保疫苗的效力能達到每劑2.5IU以上。

    2,濃縮疫苗:

    疫苗原液經過5~15倍濃縮后,加氫氧化鋁制成佐劑濃縮疫苗(也可稱為液體濃縮疫苗)。如果不加氫氧化鋁而加明膠蔗糖等凍干保護劑再行凍干,則成凍干濃縮疫苗。

    濃縮疫苗經過一段時間(約7年)的人體使用和觀察之后發現,雖然其所引出的保護效果顯著,但此疫苗的副作用也隨之增強,例如:局部疼痛及紅腫、發熱、全身 過敏性反應的發病率增高。目前我國已經淘汰原制佐劑疫苗及濃縮疫苗。

    3,精制疫苗:

    因上述情況所致,我國于1990年代下葉開始,進行地鼠腎細胞培養精制人用疫苗的研制及臨時試驗,并于1990年代末得到批準生產。此疫苗仍然使用aGT 毒株,在原代地鼠腎細胞中培養,在收取病毒培養液后,經過多步驟純化,例如,經沉淀濃縮、離子交換柱層析等方法純化,然后除菌過濾,在此工藝流程后,如果 加入氫氧化鋁則成液體佐劑型精制疫苗;如果添加凍干保護劑再行凍干而成的則稱凍干精制疫苗。在成品檢定中增加疫苗的純度檢測項目,如病毒蛋白含量、細胞 DNA殘存量。

    一般說來,原制疫苗刺激機體產生抗體較快,但抗體維持時間短;佐劑疫苗刺激機體產生抗體較慢,但抗體維持時間長。

    二、人二倍體細胞疫苗(HDCV)

    HDCV是目前國際上公認安全性及免疫效果較好的一種疫苗。有人認為如果使用得當,能提供100%的保護;現在北美和西歐等國都使用之。

    1.美國 Wistar研究所制作法:毒種為PM L503株,人二倍體細胞系 WI-38。

    工藝流程:將毒種與細胞懸液混合。加生長液后分裝在培養瓶內,靜止培養3天,形成單層后,用胰酶消化感染細胞,加入正常細胞,再加生長液靜止或旋轉培養 2~3天,洗滌細胞,替換之維持液旋轉培養。間隔3~4天收獲病毒懸液,連續收3~4次,在此期間,仍可將細胞消化分散后繼續傳代,再將所收的病毒懸液合 并,微孔過濾去除雜質,然后超濾濃縮,濃縮物用磷酸三丁酯滅活。再過濾,加凍干保護劑后凍干,即成為成品。

    2. 法國 Merieux研究所制作法:是Wistar研究所法的改良工藝。毒種為Wistar株,人二倍體細胞系MRC-5。細胞種子為第16代,生產用細胞為第27代。

    工藝流程:將毒種與細胞懸液混合,種毒量為1 LD50/20~25個細胞,以37℃磁力攪拌15分鐘,加生長液后于37℃培養3~4天,形成單層后,用胰酶消化感染細胞,以一分二的擴增法再加生長液 于37℃培養3~4天,洗滌細胞,替換EBM維持液,于35℃培養。間隔3~4天收獲病毒懸液,連續收3~4次,合并病毒懸液,微孔過濾后超濾濃縮,濃縮 物用β-丙內酯滅活26小時。再過濾,加凍干保護劑后凍干,成為成品。也可采用蔗糖梯度密度區帶離心法純化,然后再滅活和超濾濃縮,經適當的稀 釋后加保護劑進行凍干。

    現已證明,β-丙內酯會造成人白蛋白改性(modified),尤其是白蛋白高濃度時。改性的白蛋白會引出IgE類抗體,從而引發過敏反應;可能也是一種自身抗體。

    三、原代雞胚細胞疫苗(PCECV)

    1.日本制造的原代雞胚細胞疫苗,所使用的毒種是 Flury-HEP。

    工藝流程:選用7日齡無特殊致病因子(SPF)雞胚,制備成原代雞胚細胞,37℃培養形成單層后,按1:100(病毒:細胞)的種毒量感染吸附,37℃1 小時后更換液體,用無血清199培養液作維持液,于35℃培養4~6天后,收取病毒懸液,病毒滴度可達到10-6~10-8LD50/ml,合并后過濾澄 清,用0.04%β-丙內酯滅活。其后進行2~20倍的超濾濃縮。濃縮物內加明膠、乳糖、L-谷氨酸鈉作為保護劑,分裝1mL為一劑量,凍干后 為成品。純化疫苗則采用在濃縮后進行超速離心法純化。

    按0、28、160天免疫接種一次,第一針接種二周后,有90%的志愿者的抗體平均水平為1:40,第二針接種100%的志愿者抗體平均水平為1:100。

    2.德國 Behring廠制造的原代雞胚細胞培養精制疫苗,毒種是Flury-LEP毒株。

    工藝流程如下:選用9日齡的SPF雞胚,剪碎消化,混合接種毒種,35℃旋轉培養,第4天后收第一次病毒懸液,第6天與第8天各收一次病毒懸液,3次收的 病毒液合并,其病毒滴度為107.0TCID50/ml以上,用β-丙內酯4℃滅活20小時,用微孔過濾法或低速連續流離心法去除細胞碎片,用 連續流密度梯度速率區帶離心法部分純化與濃縮,收取36%的蔗糖帶,然后據抗原含量來稀釋濃縮物,加保護劑,保護劑內含有5%的人血白蛋白和降解明膠等成 份,凍干,每劑為lmL,效價單位大多在>7.5IU/劑。

    此疫苗的優點,是原材料來源充足,工藝不復雜,且能達到較高的病毒滴度,經純化后, 幾乎不含雜質,穩定性好(55℃四周效價稍降),但與血清聯合使用后,抗體應答水平不如人 二倍體疫苗,單獨使用雞胚細胞疫苗,其抗體維持時間及其GMT亦較人二倍體疫苗為差。

    四、傳代細胞系疫苗

    1,法國 Merieux研究所于1984年報導了生產精制Vero細胞培養狂犬病疫苗的結果。 他們采用微載體(Microcarrier beads)系統作為細胞培養懸浮固定物,并利用一系列的生物反應器來控制細胞與病毒的培養條件。

    Vero細胞從培養開始,就能吸附到微載體小珠上,3天以后就能鋪滿整個微載體小珠,再用 PM1503-3M病毒株感染在微載體上的細胞,病毒種毒量約1LD50/1000個細胞,維持液為含0.3%人血白蛋白的EMEM,37℃培養。從第6 天起收獲病毒懸液,連續收5~6次,整個收毒期為3周。所收獲的病毒懸液其感染滴度較為恒定,一般在106.6TCID50/mL以上。病毒原液合并后微 孔過濾澄清,并用膜式濾器濃縮10~25倍,濃縮物再以1:4000的β-丙內酯4℃滅活,然后再次超濾分子洗凈,以蔗糖梯度密度區帶離心法與 柱層析法純化。加5%人血白蛋白作保護劑,凍干,每劑量0.5ml。

    細胞主種子為124代,從生產用細胞種子第137代的單一安瓿保存的Vero細胞種子,逐級擴增細胞量直至達到生產常規的500~1000升的培養量,此 過程需用一系列生物反應器經5級細胞放大培養,約需一個月時間,到感染病毒時細胞的代次142代。這些生物反應器都是自動調節溫度、溶氧、pH、CO2、 壓力、攪拌速度等。從種子細胞到生產常量細胞,均需作細胞核學檢查及生長特征鑒定。成品檢定除常規檢測項目外,尚需作下述二方面的檢測。第一、腫瘤源性試 驗,用106個Vero細胞接種于經抗胸腺細胞血清處理過的新生大鼠(或裸鼠等免疫低下動物),同時用 Hela或Hep-2或KB細胞作為陽性對照。第二、測定痕量的細胞DNA用32P標記的 Vero細胞 DNA作探針,作 DNA-DNA分子雜交實驗。

    據 Fournier等人的報導,此疫苗的穩定性較好。4℃可貯存24個月。57例的臨床試驗表明,5針次抗體反應經ELISA法測定,7天抗體陽轉率為23%,GMT為0.23IU,14天為84.5%,抗體 GMT為1.82IU,30天陽轉率為100%,抗體 GMT為3.07IU。

    法國 Merieux研究所于1998年又報道了改變離心法而僅用柱層析法純化疫苗的臨床使用結果(15)。為了降低人血白蛋白等非病毒的蛋白含量,其工藝改進 還采用先純化后滅活病毒,以保證減少Ⅰ、Ⅲ型變態反應。使用改進工藝前疫苗(PVRV)的167人,使用改進工藝后疫苗(CPRV)的167人,以三針法 免疫,于第42天時,所有受試者的VNab滴度均大于0.5IU;CPRV組的GMT為23.0IU,PVRV組則為29.6IU。但CPRV組的全身反 應率卻比PVRV組低。

    2,我國的精制 Vero細胞培養狂犬病疫苗,所用的毒種既有aG株又有CTN株。

    工藝流程與法國巴斯德- Merieux研究所的疫苗制造工藝流程大致相同,但尚未用生物反應器培養細胞以大規模地成批生產疫苗;目前大都采用轉瓶法培養細胞,從單一安瓿保存的 Vero細胞種子,逐級傳代擴增細胞到生產常規的10升/瓶的培養量,需經過至少5~10個代次。接種病毒37℃5天后,開始收獲病毒培養液,每3天收獲 病毒培養液一次,可連續收獲病毒培養物3~5次以上,其病毒滴度可達106.5~107.5LD50/ml以上。病毒滅活劑既可用福爾馬林又可用 β-丙內酯,而且純化工藝亦有所不同,例如,我國的純化工藝是采用柱層析法。成品為1ml規格的液體疫苗。還有佐劑型液體疫苗。

    用于生產的傳代細胞需建立多級細胞種子庫;而且種子庫細胞及生產過程中每一代次細胞均需進行細胞核學檢查。目前我國對Vero細胞的最高傳代代次限制在160代。

    據我國臨床前試驗與臨床試驗的結果分析,每劑疫苗效力都達到5IU以上,穩定性好,37℃2周疫苗效力下降不明顯;4℃保存可18個月。初步的臨床試驗結 果表明,采用CTN株的疫苗其抗體陽轉率及中和抗體滴度都較好。40天時,抗體陽轉率為100%,中和抗體GMT為9.62~11.89IU,法國的維爾 博疫苗為對照組,40天時,其抗體陽轉率為100%,中和抗體GMT為10.09IU。

    用傳代細胞生產狂犬病疫苗的優點是,不受動物來源的制約、如果采用生物反應器培養細胞與病毒則能大規模工業化生產且可自動化控制,各批質量較恒定,有利于 質量控制。生產成本比人二倍體疫苗低,質量可與人二倍體疫苗相媲美。但設備的一次性投資較昂貴,生產周期較長,一旦出現污染經濟損失也大。

    五、檢定方法與標準

    在我國,從1990年版中國生物制品規程開始,明確規定狂犬病疫苗的效力檢測要求使用 NIH法,標準是每劑效力須≧2.5IU。 NIH是一種變量免疫定量攻擊的效力測定法,雖存在一些問題,但目前仍是最可靠的方法。由檢定所發放攻擊用毒種(CVS株)及參考對照疫苗。標準品穩定可 減少試驗誤差。各國均用NIH法檢測疫苗的效力,而且,有些國家還采用雙份檢測法,結果取平均值作為疫苗的效力單位。

    NIH法是將待檢疫苗及參考疫苗分別以不同濃度的疫苗免疫小鼠,間隔一周共免疫2次,于第一次免疫后的14天時,以定量的CVS攻擊,2周后判斷結果,從而求50%有效劑量(ED50),按以下公式計算效力單位。

    待檢疫苗效力=待檢疫苗ED50/參考疫苗ED50×待檢疫苗(ml/劑)/參考疫苗(ml/劑)×國家參考疫苗效價

    參考疫苗的 IU應以每毫升為單位。

    我國在2000版中國生物制品規程中明確將傳代細胞系株列為可用于生產疫苗的細胞基質,并制定了相關的檢定原則以及相關疫苗的檢定規程,同時也適當放寬了 細胞性DNA在疫苗中殘存含量的限度,現在的要求是每劑10ng為最高限度。

    疫苗的其他質量標準與要求,可參閱1990年與2000年版的中國生物制品規程。

    在國外,有些廠家進行半成品效力檢定時,利用單向免疫擴散法、放射免疫法以及抗體結合試驗(ABT)測定病毒或糖蛋白含量,作為內控質量指標。

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