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    第四節 疫苗毒種物

    時間:2018-01-24

    選擇狂犬病疫苗毒種的基本原則,首先應是固定毒,而且必須是第1血清型的狂犬病病毒,任何候疫苗候選毒株都必 須有詳細的傳代歷史記錄,必須能誘導機體產生抗街毒感染的保護作用。種子病毒應相對穩定,主種子病毒在傳10代內可以使用;必須滿足的基本條件:1.毒種 應維持一致的表現,如接種在特殊細胞基質上的細胞病變或是噬斑的特征、抗原性,以及以特殊途徑接種動物后能引出滿意的抗體應答;2.該毒株必須能被標準的 抗狂犬病病毒血清所中和。

    一、我國使用的生產毒種

    (一)aG株:是我國現用的疫苗生產毒株,來源于北京株,該毒株于1931年由北平衛生事務所袁浚昌先生從捕殺的狂犬腦組織分離,經當時的中央防疫處技術 人員在家兔腦內連傳50代所得的病毒(減毒經過見表4-6-3),命名為北京株狂犬固定毒。于1980年以前,我國曾此毒株作為羊腦疫苗的生產毒株。

    北京株在經家兔腦內再傳100代后,于1965年開始,由武漢生研所等單位用此固定毒株通過地鼠腎細胞適應傳代,傳至68代時獲得一株既能適應于原代地鼠 腎細胞,又具有與北京株固定毒免疫原相似的組織培養毒株,稱為a系株。a系株的前10代在組織培養中的產毒高峰在30天,毒力滴度為 3.5lgLD50,11~36代產毒高峰縮短至15天,到44~68代時為5天,其毒力滴度為4.5lgLD50,用a系55代毒株感染豚鼠腦所得的毒 種稱為aG株, aG株經感染豚鼠腦與單層細胞培養交替傳代,獲得毒力較穩定aGT種子株。經小動物和大動物(狗、猴)外周神經感染與中樞神經致病試驗,結果表明aGT經 外周神經感染致病率比原固定毒北京株大大降低,而北京株仍保留20~30%的致病力。腦內感染的犬腦組織切片,北京株所致的重度病理變化比率為64%,而 aGT為15%;北京株所致的輕度病理變化占9%,而aGT為50%;故認定其外周神經致病性幾乎完全喪失。

    以aGT為毒種制成試驗疫苗,經皮下免疫狗、猴,其7、14、21、30天所產生的中和抗體滴度大大高于羊腦疫苗和北京株對照組。嗣后,此疫苗經大面積人 體臨床試驗,結果表明能完全保護被瘋動物咬傷的人體。此后我國全部使用此aGT毒株作為細胞疫苗生產毒種。

    (二)CTN株:該毒株于1957年分離自山東省淄博市死于狂犬病患者腦組織。在小鼠腦內連續傳代,當傳至56代時(即CTN-M株)小鼠發病潛伏期從 11-14天縮短為3-6天,皮下致病力下降2.7lgLD50。其后CTN-M株又通過人胚肺二倍體細胞株連續傳代共100代;當傳至37代左右,其病 毒滴度提高了3.0~5.0lgLD50,命名為CTN-1-37。

    1994年,將二倍體細胞適應株CTN-1-7適應于Vero細胞,連續傳代30代,第1代的毒力即可達到107 LD50/ml,25代以后毒力可達107.5 ~108.0 LD50/ml。腦內接種后的病理切片無包涵體,對家兔肌肉、腦內注射均不致病,對豚鼠、裸鼠、乳狗進行肌肉包括近神經部位接種均不致病。小鼠連續感染3 代,潛伏期均為6天;未發現毒性逆轉現象。免疫學交叉試驗結果顯示:用aG株免疫血清中和后進行免疫原性試驗,結果中和指數為1.7×105 LD50。CTN-l株與aG株的抗原性一致,且比CVS株更密切。

    用該毒種制備的實驗性犬用活疫苗,經口服和肌注免疫接種41715頭犬,未發現疫苗株的致病性,免疫效果和保護力良好,孕犬口服活疫苗無垂直感染。犬口服 30天后中和抗體可達2.59IU/ml,陽轉率100%。35~60日齡乳犬口服1O個劑量的活疫苗,在3個月內的各時期分別殺犬取腦及唾液腺,分別在 BHK-21細胞和小白鼠腦內盲傳2代進行病毒分離,結果均為陰性。證明該毒株已充分減毒,顯示安全有效。

    1982年獲衛生部同意將此毒種擴大使用。l984年,WHO狂犬病專家委員會第七次報告中,將我國CTN-l株認可為狂犬病病毒固定毒株,列為可用于生產疫苗的病毒株。

    二、國外使用的生產毒種

    (一)適應于雞胚細胞培養的毒株:

    最有代表性的、適應于雞胚細胞培養的毒種是Flury毒株,1940年Koprowski從因狂犬病死亡的女孩腦內分離的病毒稱之為Flury毒株,將此 毒株連續在1日齡雛雞腦內傳138代,消除了其入侵唾液腺的能力;隨后又在雞胚卵黃囊傳40~50代,又降低了其對外周神經的嗜性,對狗不致病,稱之為低 代次雞胚細胞培養適應毒株,簡稱為雞胚低傳代株(low egg passage,LEP)。其后,再在雞胚傳178代以上,至此,該毒株無論在神經內外接種都喪失了對動物的致病力,但對新生乳鼠和猴進行腦內接種仍有感 染性?,F在人們將68代之前的毒株稱為LEP,136代之后的毒株稱為雞胚高傳代株(high egg passage,HEP)。

    1.日本制造的原代雞胚細胞疫苗毒株就是來源于 Flury-HEP,Yoshino于60年代初,作1日齡雞胚適應傳代,最后由近藤將此毒株適應于原代雞胚成纖維細胞,經多次選育出可作為疫苗的種子毒株。

    2.德國 Behring廠制造的原代雞胚細胞培養精制疫苗所用的毒株為 Flury-LEP毒株,毒種來源于美國 ATCC提供的雞胚第59代,適應于原代地鼠腎細胞共90代,以及適應于人二倍體細胞 WI-38共12代,其后再適應于原代雞胚細胞。在原代雞胚細胞適應的第25代(稱 LEP-C25)作為人用疫苗的主種子毒。

    (二)適應于傳代細胞培養的毒株:

    1. 適應于人二倍體細胞系的毒株:毒種為Pitman-Moore株(簡稱PM株),是固定毒,來自Pasteur株(簡稱PV株)。Wistar研究所從 1960年起篩選毒種,1962~1963年將此毒種適應于人二倍體細胞系 WI-38,共傳52代(在1964年以前制備的疫苗,其毒種代次水平為47代)。并于52代作為種子毒。病毒滴度可達到10-6.7LD50/ml。

    2. 適應于Vero細胞系的毒株:毒種來源于Wistar的PM株,簡稱Wistar株。由法國Merieux研究所將Wistar株適應于Vero細胞系和人二倍體細胞系MRC-5,稱為PM1503 3M株。

    3. Evelyn-Rokitnicki-Abelseth 毒株(簡稱ERA株):1984年加拿大的Pasteur- Merieux-Connaught公司使用此毒株用于生產人二倍體細胞疫苗。

    PV株繁衍譜系,在兔腦內傳代大于1500代;1940年Habel將PV株引入美國。Wistar研究所從NIH獲得PV-11株,經兩代兔腦傳代,在 WI-38細胞傳47~52代作為主種子毒,稱為PM株。1966年再轉至Merieux研究所,Merieux研究所將其經兔腦傳代并適應于Vero細 胞系和人二倍體細胞系MRC-5。目前PM株已經適應于三種不同的細胞系上。

    三、檢定用的攻擊毒株

    攻擊用毒株一般采用challenge virus standard (CVS) 株。CVS株來源于PV株,它有許多亞系,例如CVS-11、CVS-24、CVS-27、CVS-F3等。CVS-24株是高神經致病性的野型 (neuropathogenic wild-type)毒株,它適應于小鼠腦內傳代;現是疫苗檢定用的標準攻擊毒株。

    四、獸用疫苗所使用的毒種

    1.SAD(Street-Alabama-Duffering)候選毒株及其衍生毒株,1935年在美國Alabama州從瘋狗腦中分離到的一株狂犬病 街毒,經小鼠腦傳代成為固定毒;再經原代地鼠腎細胞、雞胚、牛腎細胞和豬腎細胞傳代后,成為疫苗候選毒株,簡稱為SAD株。SAD株再經豬腎細胞傳 35~45代,稱為ERA株。如果SAD株再經原代地鼠腎細胞在32℃條件下培養傳40~107代,成為疫苗候選毒株Vnukovo-32。

    (SAE克隆株是來自SAD B19株,通過蝕斑克隆、小鼠接種和在BHK-21細胞獲得的。SAE株:含11928個核苷酸;其中含有5個結構基因,從3’端起,依次為 核蛋白基因含1353個核苷酸、非結構蛋白(NS、或稱P、M1)基因含990個核苷酸、基質蛋白(M2)基因含803個核苷酸、糖蛋白基因含1575個 核苷酸、大蛋白(L)基因含6474個核苷酸。)

    2.減毒PV株。

    3.其它減毒疫苗株:SAD B19株、Flury-HEP、SAG1、SAG2株(21),均為通過動物或細胞傳代突變獲得的口服疫苗毒株。

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