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    第一節 微生物學

    時間:2018-01-24

    一、狂犬病病毒在分類學中的位置

    狂犬病病毒歸屬在彈狀病毒科(Rhabdoviridae),彈狀病毒科內幾乎所有的病毒都是彈狀或桿狀形態,具有相似的蛋白與RNA結構;可分為5~6 個屬,能感染人致病的僅如下兩屬,其一是水泡性口炎病毒屬,屬內典型的病毒是水泡性口炎病毒(VSV);其二是狂犬病病毒屬 (Lyssaviruses),代表種是狂犬病病毒。

    從昆蟲、蝙蝠、鼩鼱、人體內曾分離到幾種狂犬病病毒樣病毒,稱為狂犬病相關病毒(Rabies-Related Virus,RRV),RRV不一定都會引發狂犬病樣疾病,但它們都具有與典型狂犬病病毒相同的核衣殼抗原,差異在于糖蛋白的抗原性。于1979年將它們 分類在狂犬病病毒屬;目前,可將狂犬病病毒屬分為7個血清型。第l血清型,代表株是CVS24,包括野毒株及各實驗室保存的大部份毒株,是典型狂犬病病 毒。第2~7血清型是RRV;第2血清型,代表株是Lagos蝙蝠病毒;第3血清型,代表株是 Mokola病毒;第4血清型,代表株是Duvenhage病毒;第5血清型,代表株是歐洲蝙蝠病毒-1(EBL-1)從俄國人體中分離;第6血清型,代 表株是歐洲蝙蝠病毒-2(EBL-2),從芬蘭人體中分離;第7血清型,代表株是從澳大利亞蝙蝠中新分離的?,F有證據表明僅第l血清型病毒與人類狂犬病密 切相關,但有學者認為,除了第2血清型之外,其它血清型病毒均可導致人或動物感染死亡,例如Mokola病毒引起曾接種過狂犬病疫苗的狗、貓發生致死性感 染。

    在屬內尚有基因分型的提法,第1~7基因型與第l~7血清型基本是對應的。還有種群(phylogroup)的提法,按中和性單克隆抗體(McAb)的交 叉反應性及跨膜糖蛋白涉及的病毒-宿主互相作用性、免疫原性、致病性,可分為兩個種群,第一群包括第1、4、5、6、7基因型,第二群包括第2、3基因 型。用第二群病毒對小鼠進行外周攻擊,無致病性(5)。

    二、病毒的性狀

    (一)形態結構

    狂犬病病毒典型的形態是一端平坦或略凹狀,另一端半圓形,酷似子彈,故得名彈狀病毒。病毒大小為75~80×170~180nm。經組織培養 后,病毒的形態多呈兩端平坦狀的顆粒。電鏡下可見病毒內部有50nm寬的核心,核心實質為核衣殼。

    核衣殼由單股 RNA與核蛋白(N)組成,并與NS蛋白、多聚酶L蛋白締結為核糖核蛋白體(RNP);在RNP中,RNA呈螺旋對稱排列、寬度18nm,被N 蛋白緊緊地鑲嵌著;在RNP外面包圍著一層基質(M)蛋白膜。再向外就是脂雙層外包膜(Envelope),在其表面上排列著有間距性的刺突,刺突是糖蛋 白(G)構成的三聚體、長約10nm;這種三聚體性刺突,也稱為,刺突樣的外包膜表面G蛋白突起(peplomers)。見圖4-6-l。

    (二)化學組成及其功能

    狂犬病病毒除含有 RNA和蛋白質以外,尚含有類脂、碳水化合物。其含量比例為:脂類15~25%,糖3%,RNA約為3~4%,蛋白質65~75%。

    l.病毒RNA 構成病毒基因組的是單股負鏈RNA。分子量3.5~4.6×106道爾頓、約為12Kb,PV株含11932個核苷酸;其中含有5個結構基 因,從3’端起,依次為核蛋白基因含1424個核苷酸、非結構蛋白(NS、或稱P、M1)基因含991個核苷酸、基質蛋白(M2)基因含 805個核苷酸、糖蛋白基因含1674個核苷酸、大蛋白(L)基因含6475個核苷酸。在G與L基因之間存在一個不翻譯的偽基因(ψ),這是與 VSV最大的區別,而且在負鏈病毒基因組中也是罕見的。在各結構基因之間均有一個核苷酸個數不等的間隔區,從3’端N基因下游開始,依次為 2、5、5、423個核苷酸。在結構基因區的兩端還各有一段意義不明的片段,分別為3’端的58或56個核苷酸,亦稱先導RNA; 5’端的70個核苷酸。見圖4-6-2。

    2.病毒蛋白質 有5種主要的病毒蛋白,據化學性質可分為磷酸化蛋白與非磷化蛋白,以及糖蛋白等。它們在病毒的感染、復制、致病與免疫等功能方面起重要的作用。不同來源的 病毒株其結構蛋白的分子量是略有不同的。這五種病毒蛋白分列于表4-6-l。

    G蛋白是唯一暴露在病毒體外部的病毒蛋白。據其可彎曲鉸鏈分為兩個部分,含三個抗原表位區,某些株如ERA卻有五個抗原表位區;①NH2端區部(Ⅱ區): 含抗原Ⅱ表位區直到線性區253~275位氨基酸,包括Ⅵ表位264位氨基酸;②COOH端區部(Ⅲ區):含抗原Ⅲ表位區及跨膜區、胞漿區,Ⅲ表位區中 AflⅢ的第333位氨基酸殘基是決定毒力的關鍵性氨基酸;此位點氨基酸的改換,會減弱病毒在細胞間的擴散,并限制病毒在CNS中的復制。

    G蛋白的作用:①與病毒對細胞的吸附以及介導細胞攝取病毒有關;②它的胞漿功能區必須優先與RNP-M復合體相互作用,才利于病毒出芽,兩者錯配則足于使 病毒減毒(6);③G蛋白過量表達會引起受感染神經元的機能損害,而且G蛋白過量表達或大量堆積會造成神經元細胞凋亡。反之則會損害病毒體的自身功能。

    另外,在組織培養中存在著大量的可溶性G蛋白(Gs),它是由細胞直接分泌至培養液中的游離物,Gs的羧基端比正常G蛋白少58個氨基酸,分子量為 61kDa。Gs的免疫原性較差,免疫動物后,不能保護動物免受致死性病毒攻擊。

    3.病毒的脂類與糖類 病毒的糖類,主要與蛋白結合成糖蛋白,其次則是與脂類結合而成的糖脂,糖脂是構成包膜的一種成分。病毒的脂類,有磷脂、糖脂等極性脂肪,中性脂肪的主要成 分為膽固醇,脂類物質是構成病毒包膜的主要成分之一??袢〔《臼峭ㄟ^出芽方式釋放,病毒的包膜是來自內質膜,故每株病毒在不同的宿主細胞內復制后,其脂 類成份及其含量比例都有所不同。病毒的形態、抗原性、吸附、脫殼都與包膜有很大程度的關聯。

    (三)某些理化特性

    完整病毒體的等電點為:6.7~6.9;沉降系數為600~625S;懸浮密度,在氯化銫中為1.16~1.2g/cm3;在蔗糖中為1.14~1.17g/ml。

    三、病毒的特性

    (一)生物學特性

    1.組織嗜性 狂犬病病毒最大的特點之一,就是對神經組織的嗜性遠遠大于其它組織。在神經組織內病毒復制的比率遠比在其他組織內高。無論是野毒株還是減毒株,都具有嗜神 經組織的特性,僅程度略有差異。唾液腺對病毒的敏感性又比其它組織細胞高。

    病毒在神經細胞復制過程中可形成包涵體,亦稱尼基氏小體(Negri body),包涵體在胞漿內形成,大小為2~30μm;形態可為球形、卵圓形。電鏡觀察可見,包涵體內含有完整的病毒體以及病毒核衣殼的大基質、外 殼蛋白等。包涵體主要在大腦海馬回部的錐體細胞、小腦的蒲肯野細胞、脊髓后角細胞、以及皮層神經元內出現,它可作為狂犬病的確診指標之一;此外,還可把有 尼基氏小體出現部位,看成為有活動性病毒復制的區域。

    2.抵抗力 狂犬病病毒對溫度較敏感,60℃30秒、100℃2秒即可使病毒滅活。在20~22℃條件下1~2周、4℃時5~6周,其感染性幾乎完全喪失。保存液內加 入正常血清或白蛋白可保護病毒的感染性。用中性甘油(50%)保存的感染組織塊,在-20℃以下可保存4~5年。病毒懸液在冰凍或冷凍干燥條件下穩定,凍 干后4℃保存可達數年其感染性下降不明顯。病毒對紫外線、日光也較敏感。甲醛、酚、β-丙內酯、三磷酸三丁酯、汞、50~70%乙醇、碘酊、肥 皂、20%乙醚、10%氯仿、胰酶、氧化劑、表面活性劑、有機溶劑、以及在溶液pH 3~11范圍外的pH均可使病毒滅活。但硫柳汞、磺胺、抗生素等不能滅活病毒。

    據上述特性,病毒的保存多采用深低溫如-70℃下加50%甘油保存,或者加小牛血清作為保護劑在低溫條件下保存。生產疫苗用毒種多采用冷凍干燥法保存。

    (二)抗原組成

    以前認為狂犬病病毒抗原性是單一的,各株之間無型的差異,但以McAb分析研究之后,發現巴斯德毒株與其后代以及其它毒株的抗原差異較明顯,在核衣殼上存 在著不同的抗原群。盡管存在著差異,但目前所使用的疫苗病毒對街毒是有交叉保護作用的。

    1.核衣殼抗原 即N蛋白抗原,①引出補體結合抗體,②是狂犬病病毒的屬抗原、群抗原,可用于病毒的分類與鑒定。③是一種免疫保護性抗原,也介導細胞免疫。

    2.糖蛋白抗原 它位于病毒包膜的刺突上,是一種免疫保護性抗原,它還具有結構標志性抗原的性質。①引出中和抗體;同時也是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的靶點。②血清型 抗原是標志性抗原,可用于病毒學分類與流行病學的監測。③作為血凝素(凝集鵝紅細胞),可引出血抑抗體。④它某一位點的氨基酸變化,是用McAb分析強毒 株與弱毒株分子差異的基礎。

    3.第三類抗原 曾有報道,存在著第三種抗原,能引出細胞溶解性抗體,后者在補體的參與下,溶解受感染的細胞。最近,用McAb分析表明,此類抗原決定基 (epitope)與血凝素抗原決定基重疊。目前對它的本質尚不夠了解。

    四、病毒的培養與病毒復制

    (一)病毒的培養

    1.病毒接種在哺乳動物腦內,經3~7天,病毒可在腦內增殖,取其腦組織勻漿離心后,即為所培養的病毒。

    2.用6~8天齡雞胚或其它禽類的卵胚培養病毒,以絨毛尿囊膜腔接種法,在種毒后第8~10天,病毒生長增殖達到高峰,而胚胎發育卻不受影響。

    3. 狂犬病病毒對所有的哺乳類動物的細胞及禽類胚胎細胞均敏感,病毒接種在細胞中,培養3~7天便可生長增殖,在不同的細胞中病毒生長增殖的速度與產量有較大的差異。

    (二)病毒的復制

    復制的某些特點:①快速吸附與穿入:一般認為病毒顆粒在30內分鐘就能吸附到敏感的細胞上。②隱蔽期短:6~8小時。③復制周期完成時間:19~24小時,最快為6小時。

    病毒增殖性復制過程的九個步驟,依次為吸附、穿入、脫殼、轉錄、翻譯、加工、復制、裝配、成熟出芽。病毒與宿主細胞的吸附作用取決于病毒糖蛋白與細胞表面 受體等的相互作用與結合,例如,細胞表面的煙酸乙酰膽鹼受體(NAchR)、神經細胞粘附分子(NCAM,即CD56)、以及碳水化合物(主要是糖脂 類)、磷脂、神經節苷脂、某種蛋白受體。病毒通過包膜與宿主細胞膜融合或者是病毒飲入(Viropexis) 進入宿主細胞。病毒體在細胞內降解、釋出核衣殼,在某些酶的作用下脫殼;之后,病毒基因組轉錄與復制。轉錄翻譯有關的酶,合成子代病毒蛋白,在胞漿內形成 核衣殼,核衣殼的堆集形成尼基氏小體;核衣殼與M蛋白結合進行裝配,通過出芽的方式獲得宿主細胞的生物膜,從而成熟為完整的子代病毒顆粒。

    五、病毒的變異

    RNA病毒具有高度的變異率,每株病毒普遍都由復雜群體組成,這可根據其基因組結構予以區分,在恒定環境條件下,這種群體保持相對的穩定??袢〔《疽彩?如此,在每一特定的狂犬病病毒株內,顯性變異與特殊宿主相關,容易鑒定并易于與其它毒株區分開來,即使因偶發突變而可能不斷地出現新的變種,但穩定的復雜 群體因其已適應于特定環境,故仍保持現狀不變。

    病毒的減毒通常都來自于毒力株,經過選擇性過程后,減毒株則由混合群體組成,雖含有次要變異體但仍可保留致病性。例如,CVS-24至少由兩個具有不同致 病性質的變異體組成,如適應于BHK細胞的CVS-B2c與適應于神經組織的CVS-N2c,它們當中的任何一個都是依賴于環境的主要群體;但是CVS- N2c的神經嗜性和致病性卻比CVS-B2c高50倍(7)。在每株病毒內,糖蛋白的變異可達10個氨基酸被替換,這可導致致病性減弱或喪失,例如, CVS-N2c的G蛋白功能區如果被SHBRV-18(R-N2cT)的G蛋白功能區代替之后,會使CVS-N2c在肌肉注入途徑時失去致病性。

    雖然,我國的學者對不同地區分離的狂犬病病毒株進行了核酸測序分析,其結果表明不同地區的毒株是有區別,而且個別毒株的差異較大,但是,目前尚未發現,這些核酸序列的變異足于造成抗原性和免疫原性的重大改變。

    (一)街毒與固定毒

    這是兩個概念不同的定義,街毒與固定毒的根本差別在于致病力的不同,而不是抗原性的不同。街毒:是指存在于自然界感染動物體內的病毒,亦稱野毒,其對人致 病力強。固定毒:則指于實驗室條件下街毒經過動物體內連續傳代后而得之病毒;因其在動物體內連續傳代后的潛伏期逐漸縮短至5-7天時,再也不縮短,呈有規 律的固定潛伏期,因之而得名;其對人致病力弱,但仍保持其原有的抗原性。街毒與固定毒各自的生物學特性見表4-6-2。

    現在世界各地實驗室內保存的巴斯德毒株及其減毒株,最早從瘋牛分離得到,在家兔腦內連續傳90代以上而成為固定毒。我國用于疫苗生產的原始毒種 ——北京株,就是在從狂犬神經組織分離后,在家兔腦內連傳50代所得的病毒。見表4-6-3?,F在世界上多數固定毒均由這種家兔 腦內連續傳代法獲得,這是一種人工定向變異的減毒方法。

    我國學者對G蛋白的分子生物學分析顯示,街毒與固定毒G蛋白的核酸序列同源性大都低于90%,最低者為82%;它們的氨基酸序列同源性約為90~93%。 在固定毒之間核酸序列同源性則都在90%左右。然而,與狂犬病病毒神經組織嗜性最為相關的是G蛋白第333位的氨基酸殘基,即精氨酸(Arg333),如 果替換成賴氨酸(Lys333)或谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸后,病毒的毒力或嗜神經性會明顯減弱。街毒G蛋白必定是Arg333,減毒株、無毒株以及部 分固定毒株此位點則為其它氨基酸如甘氨酸、天門冬酰胺、異亮氨酸、蛋氨酸等所代替。此外,第330位的賴氨酸、第336位的天門冬酰胺、第338位的異亮 氨酸也都是決定致病力的分子基礎。

    (二)缺損干擾顆粒(Defective-Interfering particles,DI顆粒)

    把正常的病毒稱為“標準病毒”,把那些形態不同、基因組有缺陷、且又干擾正常病毒復制的病毒稱之為“缺損干擾病毒顆 ?!?;DI顆粒的形態比標準病毒短1/3~1/2,且呈非彈狀形,有大段基因缺失,基因缺失甚至可達50%。其免疫原性較差。經過長期組織培 養或高濃度的腦內傳代后,會產生較多的DI顆粒。這是在疫苗研究和生產中值得注意的問題。

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